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石油污染土壤生物修复专题


(In situ Bioremediation of the Soil Contaminated by Petroleum Hydrocarbons)

籍国东





当今世界,石油已成为人类最主要的能源之一, 当今世界 石油已成为人类最主要的能源之一, 石油已成为人类最主要的能源之一 大量

的石油及其加工品进入土壤, 大量的石油及其加工品进入土壤,造成土壤的石 油污染,给人类乃至整个生物圈带来危害, 油污染,给人类乃至整个生物圈带来危害,从而 成为世界性的环境问题. 成为世界性的环境问题.在对石油污染治理的研 究中,生物修复作为一项潜在的高效, 究中,生物修复作为一项潜在的高效,低成本的 清洁技术正日益受到重视.近十余年来, 清洁技术正日益受到重视.近十余年来,国际上 对生物修复的研究更加活跃, 对生物修复的研究更加活跃,有些国家已将此技 术用于污染土壤的实际修复, 术用于污染土壤的实际修复,并取得了显著的成 果.

1.土壤的石油污染 土壤的石油污染
是指原油和石油产品在开采,运输, 是指原油和石油产品在开采,运输, 储存以及使用过程中,进入到土壤环境, 储存以及使用过程中,进入到土壤环境, 其数量和速度超过土壤的自净作用的速 度,打破了它在土壤环境中的自然动态 平衡,使其累积过程占据优势, 平衡,使其累积过程占据优势,导致土 壤环境正常功能的失调和土壤质量的下 并通过食物链, 降,并通过食物链,最终影响到人类健 康的现象. 康的现象.

1.1土壤石油污染来源主要包括 土壤石油污染来源主要包括
溢油和泄漏; 溢油和泄漏; 污水灌溉; 污水灌溉; 油页岩矿渣堆放; 油页岩矿渣堆放; 大气沉降; 大气沉降; 药剂等的施用. 药剂等的施用.

1.2石油污染土壤的影响危害 石油污染土壤的影响危害
对土壤理化性质的影响; 对土壤理化性质的影响; 对土壤微生物的影响; 对土壤微生物的影响; 对土壤酶的影响; 对土壤酶的影响; 对农作物的影响. 对农作物的影响.

2 生物修复
国际上对生物修复的研究十分活跃, 国际上对生物修复的研究十分活跃, 有些国家已将此技术用于污染土壤的实 际修复, 际修复,其中生物修复在治理有机污染 土壤方面发展很快, 土壤方面发展很快,其关注的焦点是污 染的现场, 染的现场,而该类技术都以生物修复 (bioremediation,也称为生物补救 这 ,也称为生物补救)这 一术语为核心展开. 一术语为核心展开.

2.1生物修复的概念
生物修复(Bioremediation),Madsen , 生物修复 E.L(1991)将其解释为:生物特别是微生物催化 将其解释为: 将其解释为 降解有机污染物, 降解有机污染物,从而修复被污染环境或消除 环境中的污染物的一个受控或自发进行的过程. 环境中的污染物的一个受控或自发进行的过程. 相同的表达有: 生物再生(Bioreclamation), 相同的表达有: 生物再生 , 生物恢复(Biorestoration), , 生物恢复 生物消除(Bioelimination). . 生物消除

2.2 生物修复的主要类型
原位生物修复(In Situ Bioremediation) 原位生物修复(In
指受污染的土壤不做搬运或输送而在原位污染地 进行的生物修复处理, 进行的生物修复处理,其恢复过程主要依赖于被污 染地自身微生物的自然降解能力和人为创造的合适 降解条件. 降解条件.

异位生物修复(Ex异位生物修复(Ex-situ Bioremediation) (Ex
指将受污染的土壤,搬动或输送到它处进行的生 指将受污染的土壤, 物修复处理,这里的搬动和输送是有一定限度的, 物修复处理,这里的搬动和输送是有一定限度的, 而且更强调人为控制和创造更加优化的降解环境. 而且更强调人为控制和创造更加优化的降解环境.

2.2.1 处 理 工 艺
原位处理工艺: 原位处理工艺:
1. 泵处理 泵处理P/T工艺 工艺 (Pump/Treatment) ; 2. 生物通气工艺 (Bioventing) ; 3. 渗滤工艺 (Percolation) ; 4.空气扩散工艺(diffusing) 4.空气扩散工艺(diffusing) 空气扩散工艺

异位处理工艺: 异位处理工艺:
1. 土地耕作工艺 (land-farming); (land-farming); 2.预制床工艺; 2.预制床工艺; 预制床工艺 (Prepared bed) 堆腐修复(composting)工艺; (composting)工艺 3. 堆腐修复(composting)工艺; 4.反应器处理工艺(Bioreactor). 4.反应器处理工艺(Bioreactor). 反应器处理工艺(Bioreactor)

原位修复与异位修复的差别
在处理位置上: 在处理位置上: 原位修复强调污染物存在的初始空 间分布; 间分布; 异位修复则稍作迁移. 异位修复则稍作迁移. 在处理过程中: 在处理过程中: 异位修复比原位修复有更多的人为 调控和优化处理

3.石油污染土壤的原位生物修复(ISB) 石油污染土壤的原位生物修复( )
原位处理简单,经济,但处理时间长. 原位处理简单,经济,但处理时间长.在 长期的处理过程中, 长期的处理过程中 , 污染物可能会扩散到 深层土壤和地下水中, 深层土壤和地下水中 , 因而该技术适用的 对象为被污染时间较长且情况已经基本稳 定的土壤或面积广阔的区域. 定的土壤或面积广阔的区域.

3.1 原位生物修复 原位生物修复(ISB)的特点是: 的特点是: 的特点是
(1)工艺路线和处理过程相对简单 , 不需要复 工艺路线和处理过程相对简单, 工艺路线和处理过程相对简单 杂的设备; 杂的设备; (2)处理费用较低; 处理费用较低; 处理费用较低 (3) 被处理土壤不需要搬运,对周围环境影响 被处理土壤不需要搬运, 生态风险小. 小,生态风险小.

3.2 ISB的前提条件 的前提条件
(1) 存在具有代谢活性的微生物; ) 存在具有代谢活性的微生物; (2) 有较大的降解速率,并能将污染物浓度降低到 ) 有较大的降解速率, 符合环保标准; 符合环保标准; (3) 过程中生成的中间产物必须没有毒性; ) 过程中生成的中间产物必须没有毒性; 4) (4) 污染场地必须不含对降解菌种有抑制作用的物 否则需要先行稀释或将该抑制剂无害化; 质,否则需要先行稀释或将该抑制剂无害化; (5) 污染物必须能够被微生物利用; ) 污染物必须能够被微生物利用; (6) 污染场地的条件必须有利于微生物生长并保持 ) 活性,例如,适宜的温度,湿度等; 活性,例如,适宜的温度,湿度等; (7) 技术费用必须尽可能低. ) 技术费用必须尽可能低.

3.3 ISB的方法 的方法
微生物修复 植物修复 植物—微生物联合修复 植物 微生物联合修复

微生物法
这种方法研究的最多, 这种方法研究的最多 , 一般根据土壤污染 状况, 富集,驯化土著微生物, 状况 , 富集 , 驯化土著微生物 , 或人工接种培 养代表性的土壤微生物, 养代表性的土壤微生物 , 以研究土壤微生物受 土壤污染的影响变化, 土壤污染的影响变化 , 及土壤的污染物含量变 化. 目前在大多数实际的生物修复中应用的都 是土著微生物, 是土著微生物 , 而外来的微生物在环境中难以 保持较高的活性, 工程菌的应用受到较严格的 保持较高的活性 , 限制. 限制.

研究表明,有种类繁多的细菌, 研究表明,有种类繁多的细菌, 真菌及它们的纯化酶可以代谢石油 烃类,但是由于吸附动力学, 烃类,但是由于吸附动力学,可降 解性微生物群落, 解性微生物群落,电子受体竞争能 力等方面的限制, 力等方面的限制,土壤中的石油烃 降解非常缓慢. 降解非常缓慢.

植物修复
原理: 原理
一 , 植物直接吸收并在组织中积 累非植物毒性的代谢物; 累非植物毒性的代谢物; 二 , 植物促进生物化学反应的酶. 植物促进生物化学反应的酶 .

品种选择: 品种选择
常选用受污染区内代表性较 强的粮食作物和经济作物, 强的粮食作物和经济作物,如: 水稻,小麦,玉米,花生, 水稻,小麦,玉米,花生,棉 油菜,茶树及各种果树等. 花,油菜,茶树及各种果树等.

植物—微生物联合修复 植物 微生物联合修复

利用植物及其根际微生物共存体系净化 土壤中有机污染物 .大部分植物根上 都有菌根菌生长, 都有菌根菌生长,菌根菌和植物共生具 有独特的代谢途径, 有独特的代谢途径,可代谢自生菌不能 降解的有机物. 降解的有机物.

3.4 ISB的国内外研究现状 的国内外研究现状
目前这一领域的研究工作主要集中于以下三 方面: 方面: 1 2 3 微生物的活性 石油烃生物可降解性研究 具有高效降解力的生物选择

微生物的活性
这方面工作主要是围绕如何给微生物提供 一个更合适的环境,包括温度,湿度,酸度, 一个更合适的环境,包括温度,湿度,酸度, 营养和供氧等方面. 营养和供氧等方面. Williaw(1995)取样考察土著微生物最佳的 取样考察土著微生物最佳的 环境条件,认为一般来说应保持在PH=6.5—8.5, 环境条件,认为一般来说应保持在 , 温度27—35℃,营养元素比例(C:N:P)约 温度 ℃ 营养元素比例( : : ) 的范围内. 为300:15:1的范围内. : : 的范围内

寻找最佳营养组合,研究表明 , 的配 寻找最佳营养组合,研究表明N,P的配 比以5: 比较合适, 比以 :1~10:1比较合适,但需结合实际处 : 比较合适 理的污染土壤确定. 理的污染土壤确定. Audrew(1992)探索用有机 源(如尿素, 探索用有机N源 如尿素, 探索用有机 谷氨酸等)代替无机N源 谷氨酸等)代替无机 源.污染物氧化分解 的最终电子受体的种类和浓度也影响着生物 降解的速度和程度. 降解的速度和程度.

最终电子受体的种类和浓度影响着生 物降解的速度和程度. 物降解的速度和程度. Begona等(2001)研究生物通气,证 等 )研究生物通气, 明氧气是微生物降解的主要刺激因素. 明氧气是微生物降解的主要刺激因素. 魏德洲( 魏德洲(1997)在石油污染的处理中, )在石油污染的处理中, 采用添加过氧化氢的方法使去除率增加了 近三倍. 近三倍.

Haiirn(1996)在美国密执安州的一个污染 在美国密执安州的一个污染 地区进行了硝酸盐的内生电子受体的验证, 地区进行了硝酸盐的内生电子受体的验证, 表明BTEX(苯,乙苯,甲苯,二甲苯)能够 表明 ( 乙苯,甲苯,二甲苯) 被显著降解. 被显著降解.但是在实验设计中无法将以氧 气和硝酸盐为电子受体的降解效果区分开来. 气和硝酸盐为电子受体的降解效果区分开来. Romantschuk(2000)提出利用植物的 ( ) 根区可以为微生物降解创造最佳条件. 根区可以为微生物降解创造最佳条件.

石油烃生物可降解性研究
一方面研究各种化合物在各种微生物 作用下的降解机理和途径, 作用下的降解机理和途径,另一方面从化 合物本身的化学组成和结构上研究其影响 生物降解的内在原因, 生物降解的内在原因,总结不同类型化合 物生物降解难易的规律性, 物生物降解难易的规律性,以便开发出更 有效的生物降解技术. 有效的生物降解技术.

Riis等(1996)研究结果表明,链烷 等 )研究结果表明, 单环烷烃及苯能被有效的降解, 烃,单环烷烃及苯能被有效的降解,而环 烷烃和芳烃常常滞留于土壤中, 烷烃和芳烃常常滞留于土壤中,对这类物 质的强化性降解目前尚未取得明显效果. 质的强化性降解目前尚未取得明显效果. Krishna(1999)用微分数值模拟生 ( ) 物降解率, 物降解率,说明仅在初始高浓度状态下有 线性相关. 线性相关.

表面活性剂可以将污染物从土壤颗 粒上洗脱下来,有利于细菌的降解. 粒上洗脱下来,有利于细菌的降解. Luthy等(1996)研究得出非离子 等 ) 表面活性剂(Triton X-100)对PAHs(多 表面活性剂 对 ( 环芳烃)的溶解最有效. 环芳烃)的溶解最有效. 宋玉芳等( 宋玉芳等(1999)研究了 )研究了TW-80对 对 土壤PAHs的降解率可提高约 的降解率可提高约30%. 土壤 的降解率可提高约 .

具有高效降解力的生物选择
具有协同降解作用的同生菌群(consortia). . 具有协同降解作用的同生菌群 但目前对于具有协同关系的菌株的筛选和组 合还是一个随机的过程, 合还是一个随机的过程,其协同作用的机制 有待进一步研究. 有待进一步研究. Line 等 ( 1996 ) 用 以 黄 杆 菌 (Flavbacterium)为主的共生菌作为强化菌 为主的共生菌作为强化菌 成功地处理了PCP(五氯酚钠)污染的 剂,成功地处理了 (五氯酚钠) 土壤. 土壤.

基因工程(geneticengineeringmicroganism, 基因工程 GEM)的开发. )的开发. Charkrabarty(1998)发现能降解芳烃的 ( ) 细菌,其降解基因位于质粒上. 细菌,其降解基因位于质粒上.他利用基因工程 的手段将多种质粒嫁接到一种菌体内, 的手段将多种质粒嫁接到一种菌体内,构成一菌 多基因,可以同时降解四种石油组分, 多基因,可以同时降解四种石油组分,能把原油 中约2/3的烃类消耗 的烃类消耗, 中约 的烃类消耗,突出特点是比自然菌降解速 度快. 度快.

3.5 ISB的局限性 的局限性
(1) 要对污染地点和存在的污染物进行详细的具体 考察,一些土壤中可能不宜使用; 考察,一些土壤中可能不宜使用; (2) 受各种环境因素的影响大; 受各种环境因素的影响大; (3) 特定的微生物只降解特定类型的化合物质,状 特定的微生物只降解特定类型的化合物质, 态稍有变化的化合物就可能不会被同一微生物 酶所破坏; 酶所破坏 (4) 修复的时间相对较长 修复的时间相对较长; (5) 当污染物浓度太低,不足以维持降解细菌的群 当污染物浓度太低, 落时,残余的污染物就会留在土壤中. 落时,残余的污染物就会留在土壤中

3.6 研究工作方向: 研究工作方向:
(1) 实行有效的生物修复计划时需要采取的步骤; 实行有效的生物修复计划时需要采取的步骤; (2) 确定生物修复技术彻底降解污染物所需要的运 行周期; 行周期; (3) 监测生物修复计划的进展和污染物降解的过程; 监测生物修复计划的进展和污染物降解的过程; (4) 如何通过大量的现场试验获得可信的实际应用 数据跟踪和记录; 数据跟踪和记录; (5) 土壤的生物修复计划是否会造成新的污染或导 致污染物的扩散. 致污染物的扩散.

石油污染土壤菌剂修复实验报告
概况: 概况 沈抚灌区土壤以石油烃类污染为主,污灌 沈抚灌区土壤以石油烃类污染为主, 年限长,流量大,面积广,难降解有机污染物 年限长,流量大,面积广, (PAHs)含量高,这在国内外都非常少见,迫 含量高, 含量高 这在国内外都非常少见, 切需要经济,有效, 切需要经济,有效,易于操作的土壤原位生物 修复综合技术. 修复综合技术.

研 究 意 义:
本部分研究以微生物实验为基础, 本部分研究以微生物实验为基础,筛选污灌 土壤中解脂酶活性强的优势微生物,人工接种培 土壤中解脂酶活性强的优势微生物 人工接种培 配制成固体菌剂, 养,配制成固体菌剂,分别接种在田间和网室布 置的微区和盆栽,以不同经济作物进行试验. 置的微区和盆栽,以不同经济作物进行试验.本 文是2001年的实验布置和研究进程,主要探讨菌 年的实验布置和研究进程, 文是 年的实验布置和研究进程 剂施加的方法与条件,实现研究成果产业化, 剂施加的方法与条件,实现研究成果产业化,这 在治理大面积污灌土壤上具有重要意义. 在治理大面积污灌土壤上具有重要意义.

实验内容
田间试验
在污染现场设置试验微区,以观测不同处 在污染现场设置试验微区, 理的生物修复在自然条件下情况变化. 理的生物修复在自然条件下情况变化.

网室盆栽实验
– – –

正交实验 油浓度实验 菌剂实验

实验准备
固体菌剂
从灌区土壤中筛选出优势的土著微生物,包括细菌 从灌区土壤中筛选出优势的土著微生物,包括细菌, 真菌,共 株菌种 选择降解能力强的微生物, 株菌种, 真菌 共17株菌种,选择降解能力强的微生物,经过三级 培养制成固体菌剂. 培养制成固体菌剂. 细菌菌剂: 芽孢杆菌②动胶菌属③ 细菌菌剂:①芽孢杆菌②动胶菌属③C2④C4⑤白色 未鉴定 数量: 数量:9.51×1014(个/g) × ) 真菌菌剂: 小克银汉② 棕曲霉③ 毛霉④ ⑤ 真菌菌剂 : ① 小克银汉 ② 棕曲霉 ③ 毛霉 ④ B5⑤B6 ⑥B10⑦山大提供的黄孢原毛平革菌 ⑦ 数量: 数量:4.39×109(个/g) × )

联合修复方式
目的:考察不同经济作物(黄豆,玉米,蓖麻,沙打旺) 目的:考察不同经济作物(黄豆,玉米,蓖麻,沙打旺) 的修复情况. 的修复情况. 处理方法:均投加有机颗粒复合肥1.43kg(0.167%)+细 处理方法:均投加有机颗粒复合肥 ( ) 细 菌菌剂0.72kg(0.08%)+真菌菌剂 菌菌剂 ( ) 真菌菌剂0.72kg(0.08%) ( ) 真菌菌剂 测定方法:微生物数量采用平板计数法, 测定方法:微生物数量采用平板计数法,有机物含量用重 量法. 量法.

植物菌剂联合修复污染土壤中的微生物数量变化
300 250 8 7 6

烃 含 量 ( mg)

5 4 3 2

菌 数 ( lg)

200 150 100 50 0 1 2 3 4 5 6 7 8

总烃 细菌 真菌

1 0

样号

植物菌剂联合修复污染土壤中的微生物数 量变化
300 8 7 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8

烃 含 量 ( mg)

菌 数 ( lg)

250 200 150 100 50 0

总烃 细菌 真菌

样号

分析: 分析: 对于四种作物, 1.对于四种作物,根际微生物数量之间存在数 量级的差异. 量级的差异. 细菌数量为:沙打旺=玉米>黄豆= 细菌数量为:沙打旺=玉米>黄豆=蓖麻

真菌数量为:玉米>沙打旺>蓖麻> 真菌数量为:玉米>沙打旺>蓖麻>黄豆 四种作物根际土壤中依次相差一 个数量级

2.同对照比较起来 同对照比较起来 蓖麻根际细菌数量相差不大, 蓖麻根际细菌数量相差不大,而真菌数相 差了两个数量级; 差了两个数量级; 黄豆根际细菌数量无差别,真菌数处理比 黄豆根际细菌数量无差别, 对照低; 对照低; 沙打旺根际真菌处于同一数量级, 沙打旺根际真菌处于同一数量级,细菌则 比对照高一个数量级. 比对照高一个数量级. 玉米真菌和细菌都较对照高. 玉米真菌和细菌都较对照高.

3.土壤中总烃含量的数值表明,玉米和沙打 土壤中总烃含量的数值表明, 土壤中总烃含量的数值表明 旺对石油降解的能力强. 旺对石油降解的能力强. 还需要进一步测定PAHs的含量变化. ? 的含量变化. 还需要进一步测定 的含量变化

又以灌区植物玉米为例, 分为三种 又以灌区植物玉米为例 , 处理: 处理: 1.营养调节: 营养调节: 营养调节 2.菌剂调节 : 在投加 菌剂调节: 在投加0.5%的肥料基 菌剂调节 的肥料基 础上, 分别施加不同比例的细菌和 础上 , 真菌菌剂 3.联合修复:投加 联合修复:投加0.5%肥料 肥料+0.25% 联合修复 肥料 细菌菌剂+0.25%真菌菌剂 细菌菌剂 真菌菌剂 以空白土壤为对照

玉米不同处理的微生物数量变化 总烃(mg/kg kg) 400 300 200 100 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 样号 8 6 4 2 0

菌数(lg lg)

总烃 细菌 真菌

结果: 结果: 1 肥料的施加对微生物数量有提高作用,且随肥 肥料的施加对微生物数量有提高作用, 料的投加量增加而增加,但对石油的降解却存在 料的投加量增加而增加, 一定的界限. 一定的界限. 2 施加菌剂 真菌菌剂量少则细菌数量多,但真菌 真菌菌剂量少则细菌数量多, 菌剂量多却抑制了细菌, 菌剂量多却抑制了细菌,且对石油降解效果不如 其它处理; 其它处理; 细菌菌剂施加量不同对微生物数量 都有促进作用且数量级较高. 都有促进作用且数量级较高. 3 联合修复中,细菌数量最大,真菌数量级不高, 联合修复中,细菌数量最大,真菌数量级不高, 且总烃量残余较高. 且总烃量残余较高.

不同处理对玉米植物量的影响
玉米 1 2 3 4 5 6 7 8 9 株高(cm) 134.8 189.5 190.3 210.1 183.8 184.8 173.5 176.8 191.8 百粒重(g) 14.765 28.195 31.53 25.815 31.33 36.39 21.925 27.025 27.075 产量(kg/株) 33.33 118.75 181.25 156.25 163.75 235.00 93.75 129.00 150.00

从生物量上看: 从生物量上看: 真菌菌剂施加的效果最明显,生物量最大; 真菌菌剂施加的效果最明显,生物量最大;

细菌菌剂的施加对玉米的生物量作用不明显;, 细菌菌剂的施加对玉米的生物量作用不明显;

菌剂的量大小对植物生物量影响不太明显; 菌剂的量大小对植物生物量影响不太明显;

联合修复可以提高生物量. 联合修复可以提高生物量.

鉴定:真菌使用查氏培养基,用点植培养法和栽片培养法, 鉴定:真菌使用查氏培养基,用点植培养法和栽片培养法, 鉴定出六种菌中的五种,分别如下: 鉴定出六种菌中的五种,分别如下:
真菌 SFF-1 SFF-2 SFF-3 SFF-5 SFF-6 菌株名称 宛 氏 拟 青 霉 (Paecilomyces vaiwti Bainier) 拟青霉属(Paecilomyces Bainier) 互 隔 交 链 孢 霉 [Alternaria alternata(Fr.) Keissler] 拟青霉属(Paecilomyces Bainier) 青霉属

因孢子着生位置未定有待进一步鉴定. 注:SFF-4因孢子着生位置未定有待进一步鉴定. 因孢子着生位置未定有待进一步鉴定

细菌:革兰氏染色法 细菌 革兰氏染色法
既能观察到细菌的形态, 还可根据细胞壁的成分 既能观察到细菌的形态 , 和结构不同将所有细菌区分为两大类: 和结构不同将所有细菌区分为两大类 : 染色呈红 色为革兰氏染色阴性( 色为革兰氏染色阴性 ( G- ) , 蓝紫色为革兰氏染 色阳性(G . 色阳性 +).

分离出的十一株细菌菌株除SFB-9为G-外,其余十 为 分离出的十一株细菌菌株除 株均为G 且大都为杆菌. 株均为 +,且大都为杆菌.

优势菌株的解脂酶活性
菌类 真菌 菌株名称 SFF-1 SFF-2 SFF-3 SFF-5 SFF-6 中性红法 + ++ +++ +++ +++ 菌类 细菌 菌株名称 SFB-1 SFB-2 SFB-3 SFB-4 SFB-5 SFB-6 SFB-7 SFB-8 SFB-9 SFB-10 SFB-11 中性红法 ++ + ++ — — + + ++ + + ++

注:—无活性 +有活性 ++活性较强 +++活性强 SFF-4因其状态特殊较难断定 无活性 有活性 活性较强 活性强 因其状态特殊较难断定

讨论: 讨论:
在经过一年的污染场地原位修复后, 在经过一年的污染场地原位修复后 , 土壤中微生物状况为: 土壤中微生物状况为: 优势真菌的解脂酶活性都较强, 优势真菌的解脂酶活性都较强, 细菌以革兰氏染色阳性为主. 细菌以革兰氏染色阳性为主.

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