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分光光度法测定水体叶绿素a含量的测量不确定度分析


仲恺农业技术学院学报 ,16 (3) :25~32 ,2003
Journal of Zhongkai Agrotechnical College

文章编号 :1006 - 0774 (2003) 03 - 0025 - 08

分光光度法测定水体叶绿素 a 含量的 测量不确定度分析
余文永 , 胡迪琴 , 年   ,

黎映雯 , 朱大明 冀
( 广州市环境监测中心站 ,广东 广州 510030)
摘要 : 采用分光光度法测定湖泊 、 水库水体中叶绿素 a 含量 ,评定其测量不确定度 . 根据水体中藻 类数量的多寡 ,按 1 L 和 0. 1 L 2 个采样量采样 . 影响水体叶绿素 a 测量不确定度的因素包括分 析取样量 、 样品前处理 、 仪器吸光度读数 、 玻璃量具 、 比色皿光程等 . 按照测量不确定度的传播规 律建立数学模式 ,通过对各标准不确定度分量分析计算 ,求出合成不确定度 ( u c ) 和扩展不确定度
(U) . 结果表明 ,样品量在 1 L 和 0. 1 L 时 ,U 分别为 0. 214 mg/ m3 和 2. 32 mg/ m3 .

关键词 : 分光光度法 ; 叶绿素 a ; 水体 ; 测量不确定度 中图分类号 :X173       文献标识码 :A

   一切测量都不可避免地存在不确定度 . 20 多年来 ,国外在测量不确定度的评定方面做了 大量的工作 ,国际标准化组织 ( ISO) 于 1993 年发布了测量不确定度的评定标准[1 ] . 为了适应 全球经济一体化发展的需求 ,20 世纪 90 年代末 , 我国在检测和校准领域亦引用不确定度概 念 ,取代传统的误差评定 , 并颁布了相应的评定标准[2 ,3 ] . 中国实验室国家认可委员会按
ISO/ IEC 17025 校准和检测实验室能力的通用要求》 《 对校准和检测实验室认可时 , 亦有测量

不确定度的评定要求 [4 ] . 某一检测项目的测量不确定度是实验室经过评定给出 ,测量不确定度在某种程度上能 反映实验室的分析水平 . 目前 ,水体叶绿素 a 含量的测量不确定度分析尚未见有报道 . 作者 通过分析水体叶绿素 a 含量的测量不确定度 , 找出影响测量不确定度的因素 , 给出不确定 度 ,如实反映测量的置信度和准确性 .

1  测量方法
滤膜浓缩水样 ,并将滤膜样品置于 4 ℃ 以下冰箱 6~8 h ,用体积分数 90 %的丙酮研磨提取叶 绿素 a ,加入少量碳酸镁粉防止酸化 ,然后3 000~4 000 r/ min 离心 10 min ,取上清液 ,再提取
 

1 次 ,用体积分数 90 %的丙酮定容至 10 ml . 取上清液以体积分数 90 %的丙酮作参比 , 在 722
收稿日期 :2003 - 02 - 23

作者简介 : 余文永 (1972 - ) ,男 ,广东饶平人 ,助理工程师 .

   按浮游植物采样方法 [5~7 ] 采样 ,水库水样品量为 1 L ,湖泊 、 池塘水为 011 L. 用玻璃纤维

   26

仲恺农业技术学院学报

第 16 卷

型光栅分光光度计上分别读取 750 、 、 、 nm 波长处的吸光度 ,根据下列公式 ( 1) 计算 663 645 630 叶绿素 a 含量 .   C =
[ 11164 ( D663 - D750) - 2116 ( D645 - D750) + 0110 ( D630 - D750) ] ×V 1 V 2δ V 2 为样品体积 (L ) ; D 为吸光度 ; V 1 为定容体积 ( ml ) ; ( 1)

   式中 : C 为叶绿素 a 含量 ( mg/ m3 ) ;

δ为比色皿光程 ( cm) .

2  建立数学模型

   由公式 ( 1) 可见 ,被测样品叶绿素 a 浓度 C 的合成不确定度 ,来源于 4 个波长的吸光度 、 定比体积 ( 比色管) 、 样品体积 ( 容量瓶) 和比色皿光程的不确定度 . 由不确定度的传播规律得 出被测量叶绿素 a 含量 C 的合成不确定度 uc ( C) 的方差 ,见公式 ( 2) .   u2 ( C) = c 9C 9D750
2

9C 2 9C 2 ×u2 ( D645) + × 9D645 9D630 9C 2 9C 2 9C 2 2 ) ( 2) u ( D630) + ×u2 ( V1) + 9V ×u2 ( V2) + δ ×u2 (δ 9V1 9 2    式中 : uc ( C) 为样品中叶绿素 a 含量测定的合成不确定度 ; ×u2 ( D750) +
u ( D750) 为 750nm 波长吸光度的标准不确定度 ; u ( D663) 为 663nm 波长吸光度的标准不确定度 ; u ( D645) 为 645nm 波长吸光度的标准不确定度 ; u ( D630) 为 630nm 波长吸光度的标准不确定度 ; u ( V 2) 为样品体积的标准不确定度 ; u ( V 1) 为样品定容体积的标准不确定度 ; ) u (δ 为比色皿光程的标准不确定度 .

   公式 ( 2) 中各影响因子的传播系数为 :

C ( D750) =

C ( D663) =

C ( D645) =

C ( D630) =

  C ( V 1 ) =

9C [ 11164 ( D663 - D750) - 2116 ( D645 - D750) + 0110 ( D630 - D750) ] = 9V 1 V 2δ

9C 9D663

2

×u2 ( D663) +

9 . 58 V 1 9C = 9D750 V 2δ 2 . 16 V 1 9C = 9D645 V 2δ 0. 1 V1 9C = 9D630 V 2δ 11 . 64 V 1 9C = 9D663 V 2δ

( 3) ( 4) ( 5) ( 6) ( 7)

第3期

余文永 , 等 : 分光光度法测定水体叶绿素 a 含量的测量不确定度分析

   27

3  测量不确定度评定
311   标准不确定度分量评定

Absorbency s ( x)

31111   个波长吸光度的标准不确定度   4 分别采集水库水 ( 样品量为 1 L ) 和湖泊水 ( 样品量

3111111   个波长吸光度的不确定度 A 类评定   个波长吸光度的不确定度 A 类评定 ( uA ) 4 4

3. 1. 1. 2  4 个波长吸光度的不确定度 B 类评定  722 型分光光度计最小刻度的变化为 0. 001 ,则 0. 001 = 5. 77 × - 4 10 3

3. 1. 1. 3   个波长吸光度的标准不确定度   4 按公式 ( 10) 分别计算出样品量为 1 L 和 0. 1 L

为 011 L ) 进行 4 个波长吸光度的重复性试验 ,此部分不确定度包含研磨 、 离心等前处理过程 的影响 .    个波长吸光度的标准不确定度 ( u ( DW ) ) 由以下两部分组成 : 重复性试验的不确定度 4 (A 类评定 , uA ) 和分光光度计刻度的不确定度 (B 类评定 , uB ) ,计算公式 :
u ( DW ) = uA + uB
2 2

即为重复性试验的平均值标准偏差 ( sx ) . 样品量为 1 L 和 011 L 时 ,5 个平行样品 4 个波长吸 光度平均值及其标准偏差见表 1.
表 1   个波长吸光度均值 ( x ) 及其标准偏差 ( s ( x) ) ( n = 5) 4
Table 1   Absorbency ( x ) and standard variation ( s ( x) ) of four wavelengths

吸光度均值 x

时 ,4 个波长吸光度的标准不确定度 ( u ( DW ) ) ( 表 2) .

9C [ 11164 ( D663 - D750) - 2116 ( D645 - D750) + 0110 ( D630 - D750) ] V 1 ( ) )   C (δ = δ = 8 2 9 - V 2δ   C ( V 2) =
750nm 0. 003 0. 000

样品量 1 L Volume of sample : 1 L

u ( D750) u ( D663) u ( D645) u ( D630)

9C [ 11164 ( D663 - D750) - 2116 ( D645 - D750) + 0110 ( D630 - D750) ]V 1 = 9V 2 - V 22δ
样品量 1 L Volume of sample :1 L
663nm 645nm 0. 0166 0. 0054 630nm 750nm 663nm 645nm 0. 0046 0. 0022 0. 028 0. 0094 5. 10 × 10
- 4

( 9)

( 10)

4. 00 × 10

- 4

4. 00 × 10

- 4

2. 00 × 10

uB =

表 2   个波长吸光度的标准不确定度 ( u ( DW ) ) 4

Table 2   Standard uncertainty of repeated reading of absorbency in four wavelengths

样品量 0. 1 L Volume of sample : 0. 1 L
u ( D750) u ( D663) u ( D645) u ( D630)

5. 77 × 10 7. 70 × 10 7. 02 × 10

- 4 - 4

7. 02 × - 4 10
- 4

样品量 011 L Volume of sample :0. 1 L
- 4

630nm

0. 0068

6. 32 × 10

- 4

2. 45 × 10

- 4

2. 00 × - 4 10

6. 11 × - 4 10 8. 56 × - 4 10 6. 27 × - 4 10 6. 11 × - 4 10

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仲恺农业技术学院学报

第 16 卷

3. 1. 2   比色皿光程的标准不确定度 (B 类)   《国家计量检定规范》 - 96 规定 , 比色皿光 178

程对比最大允差为 0. 5 % ,属 B 类评定 ,则
) u (δ =

0. 5 % = 2 . 89 × - 3   ( cm) 10 3

3. 1. 3   定比体积 ( 10 ml 比色管) 的标准不确定度   定比体积的标准不确定度主要来源于玻

璃量具的最大允差 、 温度变化引起的体积改变及量具刻度读数重复性的标准不确定度分量 .
3. 1. 3. 1   ml 比色管允差引起的标准不确定度   A 级标准容器要求 ,10 ml 比色管允差 10 按

为 ± 1 ml ,自由度 V = ∞,属 B 类评定 ,则 0.
u ( V 1 - 1) =

0. 1 = 5 . 77 × - 2   ( ml ) 10 3

3. 1. 3. 2   温度变化引起比色管体积变化的标准不确定度   设温度变化 ± ℃, 水的膨胀系 3

数在 20 ℃ ,α= 2. 1 × - 4 / ℃,则 时 10 u ( V1 - 2) = α = 2 . 1 × 10 - 4 × × . 0 = 6 . 3 × - 3   ( ml ) 3 10 10 Vt
3. 1. 3. 3   比色管定比刻度读数重复性引起的标准不确定度   将比色管称干重 ,加蒸馏水至

定比刻度 ,再称重 ,将两次称重之差换算成体积 ,重复 5 次 ,换算体积的标准偏差就是定比刻 度读数重复性引起的标准不确定度 ( u ( V 1 - 3 ) ) ( 表 3) .
表3  比色管定比刻度读数重复性试验
Table 3   Repeatability test in reading colorimetric tube scale 1# ) 称重 Weight/ g (22. 5 ℃ 30. 261 0 10. 044 1 10. 078 1 20. 183 5 2# 30. 231 4 10. 014 5 10. 047 9 20. 183 5 3# 30. 190 4 9. 973 5 10. 006 9 20. 183 5 4# 30. 233 4 10. 016 5 10. 049 9 20. 183 5 5# 10. 005 5 10. 038 9 20. 183 5
u ( V1 - 3 ) / ml

30. 222 4 1. 59 × - 3 10

水的质量 Mass of water/ g
) 水的体积 Volume of water/ ml (20 ℃

管干重 Net weight of tube/ g

3. 1. 3. 4   定比体积的标准不确定度   定比体积 ( 10 ml 比色管) 的标准不确定度为 :
u ( V 1) = ( V1 - 1) 2 + ( V1 - 2) 2 + ( V1 - 3) 2 ( 5 . 77 × - 2 ) 2 + ( 6 . 3 × - 3 ) 2 + ( 1 . 59 × - 3 ) 2 10 10 10

=

= 5 . 81 × - 2 ( ml ) 10 3. 1. 4   样品体积 ( 容量瓶) 的标准不确定度   样品体积的标准不确定度来源与定容体积相

同.
3. 1. 4. 1   L 容量瓶的标准不确定度 1 ( 1) 1 L 容量瓶允差引起的标准不确定度 :1 L 容量瓶 (A 级) 最大允差为 ± 40 ml ,自由 0.

度 V = ∞, 属 B 类评定 ,则
u ( V2 - 1) =

0 . 40 = 0 . 23   ( ml ) 3

  ( 2) 温度变化引起容量瓶体积变化的标准不确定度 : 设温度变化 ± ℃, 水的膨胀系数 3 - 4 在 20 ℃ ,α= 2. 1 × 时 10 / ℃,则

第3期

余文永 , 等 : 分光光度法测定水体叶绿素 a 含量的测量不确定度分析

   29

u ( V2 - 2) = α = 2 . 1 × 10 Vt

- 4

× × 000 . 0 = 0 . 63   ( ml ) 3 1

  ( 3) 1 L 容量瓶的标准不确定度 :1 L 容量瓶刻度线读数重复性的不确定度较小 ,可忽略 不计 ,则 1 L 容量瓶的标准不确定度为 :
u ( V 2) = u ( V 2 - 1 ) + u ( V 2 - 2 ) = 0 . 67   ( ml )
2 2

3. 1. 4. 2   1 L 容量瓶的标准不确定度 0.

  ( 1) 0. 1 L 容量瓶允差引起的标准不确定度 :0. 1 L 容量瓶 ( A 级) 最大允差为 ± 10ml , 0. 自由度 V = ∞,属 B 类评定 ,则
u ( V2 - 1) =

0 . 10 = 5 . 77 × - 2   ( ml ) 10 3

  ( 2) 温度变化引起容量瓶体积变化的标准不确定度评定 : 设温度变化 ± ℃, 水的膨胀 3 - 4 系数在 20 ℃ , α= 2. 1 × 时 10 / ℃,则
Vt u ( V2 - 2) = α = 2 . 1 × 10
- 4

× × . 0 = 6 . 3 × - 2   ( ml ) 3 100 10

  ( 3) 容量瓶刻度读数重复性引起的不确定度评定 : 方法同比色管读数重复性试验 ,换算 体积的标准偏差就是容量瓶刻度引起的标准不确定度 ( u ( V 2 - 3 ) ) ( 表 4) .
表4  容量瓶定容刻度读数重复性试验
Table 4   Repeated test in the reading of container bottle scale 1# ) 称重 Weight/ g (22. 5 ℃ 157. 648 4 99. 677 8 100. 011 8 57. 970 6 2# 157. 603 6 99. 633 0 99. 967 0 57. 970 6 3# 157. 633 1 99. 662 5 99. 996 5 57. 970 6 4# 157. 632 3 99. 661 7 99. 995 7 57. 970 6 5# 99. 662 1 99. 996 1 57. 970 6
u ( V 2 - 3 ) ml

157. 632 7 7. 27 × - 3 10

水的质量 Mass of water/ g
) 水的体积 Volume of water/ ml (20 ℃

瓶干重 Net weight of bottle/ g

  ( 4) 0. 1 L 容量瓶的标准不确定度为 :
u ( V 2) = ( V2 - 1) 2 + ( V2 - 2) 2 + ( V2 - 3) 2 ( 5 . 77 × - 3 ) 2 + ( 6 . 3 × - 2 ) 2 + ( 7 . 27 × - 3 ) 2 10 10 10

= 3. 2   计算合成标准不确定度

= 6 . 37 × - 2 ( ml ) 10

   样品量为 1 L 和 0. 1 L 时 ,标准不确定度分析结果分别见表 5 、 6. 将各波长吸光度均 表 值代入公式 ( 7) ~ ( 9) ,按公式 ( 3) ~ ( 9) ,计算出样品量为 1 L 和 0. 1 L 时 ,各影响因子的传播 系数 ,再将各影响因子的传播系数和标准不确定度分量代入公式 ( 2) ,计算合成不确定度 ,结 果见表 7.
3. 3   计算扩展不确定度 U

   样品量为 1 L 的扩展不确定度 ,取 k = 2 ,则
3 U1 = k ×uc ( C1) = 0. 214 ( mg/ m )

   样品量为 0. 1 L 的扩展不确定度 ,取 k = 2 ,则
U2 = k ×uc ( C2 ) = 2. 32 ( mg/ m3 )

   30

仲恺农业技术学院学报 表5  样品量为 1 L 时的标准不确定度分析
Table 5   The evaluation of standard uncertainty ( volume of sample :1 L)

第 16 卷

标准不确 定度分量 K inds of standard uncertainty
u ( D750) u ( D663) u ( D645) u ( D630) u ( V2 ) u ( V1 )

不确定度来源 Sources of uncertainty
750nm 波长吸光度的标准不确定度 Standard uncertainty of absorbency at 750nm 663nm 波长吸光度的标准不确定度 Standard uncertainty of absorbency at 663nm 645nm 波长吸光度的标准不确定度 Standard uncertainty of absorbency at 645nm 630nm 波长吸光度的标准不确定度 Standard uncertainty of absorbency at 630nm

分布特征 Character of distribution 正态 Normal distribution 均匀 Mean distribution 正态 Normal distribution 均匀 Mean distribution 均匀 Mean distribution 均匀 Mean distribution 正态 Normal distribution

类型 Type of evaluation
A类 Type A B类 Type B A类 Type A B类 Type B B类 Type B B类 Type B A类 Type A B类 Type B

标准不 确定度 Standard uncertainty
5. 77 × - 4 10 7. 70 × - 4 10 7. 02 × - 4 10 7. 02 × - 4 10 6. 7 × - 4 (L) 10 5. 81 × - 2 ( ml) 10

样品体积的标准不确定度 Standard uncertainty of sampling scale volume 样品定比体积的标准不确定度 Standard uncertainty of sampling scale volume

) u (δ

比色皿光程的标准不确定度 Standard uncertainty of colorimetric utensil thickness

均匀 Mean distribution

2. 89 × - 3 ( cm) 10

表6  样品量为 0. 1 L 时的标准不确定度分析
Table 6   The evaluation of standard uncertainty ( volume of sample :0. 1 L)

标准不确 定度分量 K inds of standard uncertainty
u ( D750) u ( D663) u ( D645) u ( D630) u ( V2 )

不确定度来源 Sources of uncertainty

分布特征 Character of distribution 正态 Normal distribution 均匀 Mean distribution 正态 Normal distribution 均匀 Mean distribution 均匀 Mean distribution 正态 Normal distribution

类型 Type of evaluation
A类 Type A B类 Type B A类 Type A B类 Type B B类 Type B A类 Type A B类 Type B A类 Type A B类 Type B

标准不 确定度 Standard uncertainty
6. 11 × - 4 10 8. 56 × - 4 10 6. 27 × - 4 10 6. 11 × - 4 10 6. 37 × - 5 (L) 10

750nm 波长吸光度的标准不确定度 Standard uncertainty of absorbency at 750nm 663nm 波长吸光度的标准不确定度 Standard uncertainty of absorbency at 663nm 645nm 波长吸光度的标准不确定度 Standard uncertainty of absorbency at 645nm 630nm 波长吸光度的标准不确定度 Standard uncertainty of absorbency at 630nm

样品体积的标准不确定度 Standard uncertainty of sampling scale volume

u ( V1 )

样品定比体积的标准不确定度 Standard uncertainty of sampling scale volume

均匀 Mean distribution 正态 Normal distribution

5. 81 × - 2 ( ml) 10

) u (δ

比色皿光程的标准不确定度 均匀 Standard uncertainty of colorimetric utensil thickness Mean distribution

2. 89 × - 3 ( cm) 10

第3期

余文永 , 等 : 分光光度法测定水体叶绿素 a 含量的测量不确定度分析 表7  样品量为 1 L 和 0. 1 L 时各影响因子的传播系数和合成标准不确定度计算结果
Table 7   Dissemination coefficient of influence factors and combined standard uncertainty ( volume of sample : 1 L and 0. 1 L)

   31

样品量 1 L volume of sample 1 L 各影响因子传播系数
Dissemination coefficient of influence factors
C1 ( D750) C1 ( D663) C1 ( D645) C1 ( D630) C1 ( V1 ) C1 ( V2 ) ) C1 (δ

样品量 0. 1 L volume of sample 0. 1 L
C2 ( D750) C2 ( D663) C2 ( D645) C2 ( D630) C2 ( V 1 ) C2 ( V 2 ) ) C2 (δ uc ( C2 )

- 95. 8 116. 4 - 21. 6 1. 0 0. 153 - 1. 53 - 1 . 53 0. 107 ( mg/ m3 )

- 9. 58 × 2 10 1. 164 × 3 10 - 2. 16 × 2 10 10 2. 85 - 2. 85 × 2 10 - 28. 5 1. 16 ( mg/ m3 )

bined standard uncertainty

4  结语

   分析结果显示 ,用分光光度法测定水体叶绿素 a ,样品量为 1 L 和 0. 1 L 的测量不确定度 分别为 0. 214 和 2. 32 mg/ m3 . 影响水体叶绿素 a 含量的测量不确定度分量主要是波长在 750 、 、 nm 处吸光度的标准不确定度 ,而测量使用的各种量具则影响甚微 . 影响吸光度 663 645 不确定度的因素贯穿整个测量过程 , 主要来源于研磨 、 离心 、 样品的新鲜度等几个方面 . 为 了确保分析结果的准确可靠 ,样品采集后应及时抽滤 、 分析 ,如不能及时处理则应在低温避 光处保存 ,并加 1 %碳酸镁粉悬浊液保鲜样品 . 在叶绿素 a 提取步骤应充分研磨 ,离心转速应 达到规定的 3000~4000 r/ min. 提取液在 750 nm 的吸光度应控制在 0. 005 以下 ,否则将对测 量结果产生明显影响 . 致谢 : 原国家标准物质研究中心罗涤明老师对本文的计算过程进行了指导 ,特此致谢 !

参考文献 :

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合成标准不确定度 Com2

uc ( C1 )

   32

仲恺农业技术学院学报

第 16 卷

The evaluation of uncertainty in measuring chlorophyll a with spectrometry
Y Wen2yong , HU Di2qin , NIAN Ji , LI YING wen , ZHU Da2ming U 2
( Guangzhou Enviromental Monitoring Center , Guangzhou 510030 , China)

Abstract : Using spectrometry to measure chlorophyll a of lake , reservoir , and evaluating its uncertain2 ty. According to alga amount of water , we choosed 2 sample volume ( 1 L and 0. 1 L ) . Impacting fac2 tors of measuring uncertainty include : the amount of the sample water , the samples handling before tainty regulations to establish the mathematics mode and calculate each standard uncertainty , we got combined standard uncertainty ( uc) and expanded uncertainty (U) . Results of U were : 0. 214 mg/ m3 ( 1 L of sample volume) ,2. 32 mg/ m3 ( 0. 1 L of sample volume) . Key Words : spectrometry ; chlorophyll a ; water ; uncertainty of measurement ( 上接第 24 页)

with butachlor and atrazine with different concentrations , and with water as control . The results showed

that cocozelle seed germination rate decreased with increase of concentrations of the chemicals when the

the fine sands were treated with 10 ,20 ,50 and 100 g/ L butachlor and atrazine , respectively. Compared germination rate was observed. When the seedlings in trifoliate period were sprayed with 10 ,20 ,50 ,

with control , a significant difference of the effect of the chemicals with different concentrations on seed

100 ,150 and 200 mg/ L butachlor and atrazine respectively , the total content of chlorophyll , contents of

nificant difference of effect of two chemicals on contents of chlorophyll a , chlorophyll b and carotenoid total content of chlorophyll , and treatment time was found after the seedlings were sprayed with 100 mg/ L butachlor and atrazine for 2~10 d , respectively.

was also observed. A negative relationship between the contents of chlorophyll a and chlorophyll b and

analysis , the reading of spectrometry , glass utensils and the thickness of colorimeter. Based on uncer2

【责任编辑   曾东发】

Effect of butachlor and atrazine on cocozelle seed germination and photosynthetic content in the seedlings
(Division of Teaching Affairs , Zhongkai Agrotechnical College , Guangzhou 510225 , China)

Abstract : The experiment was conducted by treating the fine sands in which the cocozelle seed sown

chlorophyll a , chlorophyll b and carotenoid all decreased with increase of the concentrations , and a sig2 Key words : cocozelle ( Cucurbita pepo L. ) ; butachlor ; atrazine ; chlorophyll ; carotenoid

ZHANG Wei2feng , Y Xian2mao , LIANG Guan2sheng , HE Wen2feng U

【责任编辑   曾东发】


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