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waters液相色谱质谱仪培训教程


RIGHT ON TIME

2004

Quattro Premier LC/MS/MS系统

RIGHT ON TIME 电离源:ESI/APCI/ESCI… 流路切换到 LC或MS

2004

Quattro Premier

观察窗

/>直接进样器

电源及 EPC复位开关

注射泵

RIGHT ON TIME

2004

Quattro Premier

RIGHT ON TIME

2004

APCI 接口
初级泵 离子源区 涡轮分子泵

提取锥孔 雾化器气 脱溶剂气 隔离阀 样品锥孔 透镜
RF

分析器

排气垫 样品 探头 可清洗 挡板 电晕 放电 针 排气

2004 RIGHT ON TIME

API接口:Z-Spray 接口

RIGHT ON TIME

萃取锥孔 毛细管喷口 取样锥孔 RF六极杆 -离子桥

可清洗的金 属挡板

双正交采样技术可避免污染及提高灵敏度

2004 RIGHT ON TIME

离子通道
3. The ions are filtered in MS1 according to their mass to charge ratio (m/z) 4. The mass separated ions undergo CID in the hexapole collision cell 5. The fragment ions are filtered in MS2 according to their mass to charge ratio

RIGHT ON TIME

2. Ions are transferred to the analysers through a hexapole lens

1. Samples from the liquid introduction system enter the ionisation source at atmospheric pressure

6. The ions are detected by an off-axis photomultiplier off-axis detector.

2004 RIGHT ON TIME

什么是质谱?
样品转变为气态离子。 利用离子在电场和磁场中的运行性质,将这些 离子在真空状态下按其质荷比(m/z)进行分离。 质谱图就是一张以相对离子流强度为纵坐标、 以质荷比(m/z)为横坐标的曲线图。

RIGHT ON TIME

RIGHT ON TIME

2004

LC/MS 系统构成
质量分析器
+ + + + + + + +

检测离子
+ + +

离子源
+ + + ++ +

样品与溶剂脱 离及电离 EI ESI LC/MS APCI 接口

-

+ + +

离子识别
Quadrapole Time of Flight Fourier Transform …

离子检测

HPLC

数据系统 质谱

RIGHT ON TIME

2004

LC/MS 数据形式
191

91 79 107

G a m a b u f o t a li n ( III)

O

M -162 241

M -79 323

O

M -36 366
M -18

123

145

201 175 341

M+
402 384
O H

O H

O H H

100

150

200

m/z

250

300

350

TIC

TIC

色谱

保留时间

RIGHT ON TIME

2004

LC/MS 数据形式

LC/PDA = 254 nm

LC/MS = 228 m/z

228 m/z 162 m/z
3.00 4.00 5.00 Min utes

LC/MS = 162 m/z

LC/MS = 198 m/z

1.00

2 .0 0

198 m/z
6.00

7 .0 0

8.0 0

9.00

1 0.00

2004 RIGHT ON TIME
Pesticide Mix
pest03 100 %

LC/MS 数据形式
4.65 5.05 5.65 3.82 8.02 10.62 12.71 8.62

RIGHT ON TIME
1: Scan ES+ TIC 5.77e6

0.74

0 pest03 100

4.65

1: Scan ES+ 229 2.08e6

%

0 pest03 100

5.10

1: Scan ES+ 217 8.23e5

%

0 pest03 100

5.64

1: Scan ES+ 199 1.51e6

%

0

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

9.00

10.00

11.00

12.00

13.00

14.00

Time

2004 RIGHT ON TIME

RIGHT ON TIME

EI源
把样品分子电离成离子
样品以气态进入真空腔后, 灯丝被加以70ev的固定电压 ,造成了对分子的轰击和碰 撞。如果电子能量大于样品 分子的电离电位,就会导致 样品分子的电离,从而形成 了许多离子化碎片 在电子能量一定的情况下, 一定的有机化合物分子所生 成的离子的相对强度是一定 的,所以EI源可通过谱库匹 配来定性。

RIGHT ON TIME
Repeller
+

2004

传统的样品电离方式:EI源
灯丝
-

EI源:电子轰击电离源
离子到 分析器

样品入口

M

-

可得经典的质谱谱图。 可查询质谱库,质谱结 果可用工业标准谱库检 索,是绝对的化合物鉴 定
402

收集器
191 91 79 107 123 135 145 175

离子聚 焦透镜
M + -3 6 M + -7 9
323 366

M + - 162
241

201

341

M + -1 8
384

M+

相对易得,耐受性好。
?

H ig h R e s o lu tio n M a s s S p e c tro m e try, B ro w n , K a m a n o , P e ttit, O rg . M a s s S p e c ., 1 9 7 2
91 79 107 191

谱图可解析,阐明结构 信息。 但是,测定的分子量范 围、流速范围、灵敏度 有限;可测的化合物类 型有限。

M + - 162
241
201 175

M + -7 9
323

M + -3 6
366

M+
402

123

145

M + -1 8
341 384

100

150

200

m /z

250

300

350

W a te rs In te g rity L C /M S S y s te m , P fiz e r, 1 9 9 6

RIGHT ON TIME

2004

LC/MS 系统构成

EI电离源

样品引入

液质联用接口 至 真空

离子源

质量分析器

检测器

高真空部分

API电离源

样品引入

离子源

液质联用接口 至 真空

质量分析器

检测器

高真空部分

RIGHT ON TIME

2004

10
MALDI

1

Molecular Weight

10

2

10

3

10

4

10

5

APCI

MALDI

Polarity

LC

Polarity

EI/LC GC

Electrospray (ESI)

GC

GC

Volatility

LC

MALDI

Volatility

2004 RIGHT ON TIME

RIGHT ON TIME

大气压电离技术

大气压电离源是一种常压电离技术,可分为:
电喷雾电离(ESI) 大气压化学电离(APCI) Electrospray Atmospheric Pressure Chemical Ionization

2004 RIGHT ON TIME

电喷雾电离(ESI)

RIGHT ON TIME

电喷雾离子化分为三个过程: 1. 形成带电液滴 2. 溶剂蒸发和液滴碎裂 3. 形成气相离子
随着液滴的挥发,电荷密度增

毛细管2-4kV

- - + -+ 大, 离子集中到液滴表面 + + + + + + -+ + -+ + + ++ - -+- ++ +++ + + +-+ + ++ + - + + 离子从液滴表面 + + -+
含各种离子的液滴 蒸发出来

2004 RIGHT ON TIME

ESI Probe

RIGHT ON TIME

2004 RIGHT ON TIME

ESI源工作原理

RIGHT ON TIME

电喷雾电离(ESI)是在液滴变成蒸汽,产生离子发射的过程 中形成的,溶剂由液相泵输送到ESI Probe,经其内的不锈 钢毛细管流出,这时给毛细管加2-4kv的高压,由于高压和 雾化气的作用,流动相从毛细管顶端流出时,会形成扇状喷 雾,使液滴生成含样品和溶剂离子的气溶胶。
由于毛细管被加高压,造成氧化还原反应,形成带电液滴。 溶剂蒸发,离子向液滴表面移动,液滴表面的离子密度越来越大,当达到 Rayleigh极限时,即液滴表面电荷产生的库仑排斥力于液滴表面的张力大致 相等时,液滴会非均匀破裂,分裂成更小的液滴,在质量和电荷重新分配后 ,更小的液滴进入稳定态,然后再重复蒸发、电荷过剩和液滴分裂这一系列 过程。 对于半径<10nm的液滴 , 液滴表面形成的电场足够强,电荷的排斥作用最终 导致部分离子从液滴表面蒸发出来,而不是液滴的分裂 ,最终样品以单电 荷或多电荷离子的形式从溶液中转移至气相,形成了气相离子。 多肽,蛋白等生物大分子,有多个可质子化基团,而且相距较远,在ESI环 境中会生成多质子化分子(分子离子峰)。 离子所带电荷的多少取决于分子中酸性基团和碱性基团的体积和数量。

毛细管电离电压(Capilary) 2004 RIGHT ON TIME
RIGHT ON TIME

ESI 调谐窗口设置

Positive ES 2.50 3.75

Negative ES 2.00 3.00

2004 RIGHT ON TIME

所用气体

RIGHT ON TIME

氮气(90PSI)
雾化气 脱溶剂气 锥孔气

氩气(15PSI)
碰撞气

RIGHT ON TIME

脱溶剂气流速(Gas Flow) 2004

ESI 调谐窗口设置

Desolvation Gas 300 1000

脱溶剂气温度Source Temperatures 2004
RIGHT ON TIME

ESI 调谐窗口设置
Infusion (5 - 40 ?l/min)
Desolvation temp.

120

HPLC (100 - 300 ?l/min)
Desolvation temp.

300

RIGHT ON TIME

2004

ESI 接口
机械泵 离子源 涡轮分子泵

雾化器 气

脱溶剂气 隔离阀 样品锥孔

提取锥孔
RF

质量分析器 透镜

样品 探头

可清洗 挡板

排气衬垫 排气口

2004 RIGHT ON TIME

ESI 的离子抑制现象

RIGHT ON TIME

样品分子离子和电解质离子对电荷及占据液滴 表面的竞争导致离子抑制,离子在液滴表面过 于密集,制使某些样品分子离子不能到达液滴 表面,这一现象叫离子抑制。 一般而言,被分析物的响应随其他的电解质浓 度增高而降低。

2004 RIGHT ON TIME

影响化合物ESI电离的因素
被分析物的浓度 基质的性质 流速 液相流动相的影响 化合物的表面活性

RIGHT ON TIME

RIGHT ON TIME

2004

ESI:被分析物浓度对其响应的影响
刚好饱和
AH+ A AH+ AH+ AH+ AH+ A AH+X- AH+ AH+ AH+XAH+

信号的饱和归因于离子在液滴表面过于密集,致使某些被分析物离子不能到达 液滴表面。 未饱和
AH+ AH+ AH+XAH+ AH+ AH+

过饱和
AH+AH+ A AH+ AH+ AH+ AH+ AH+X- A AH+X- AH+ AH+ A A AH+ A AH+XAH+ AH+
10000

S ig n a l (a rb . u n its )

1000

100

?离子的释放取决于浓度. 信号在 10 ?M时 达到饱和. ?线性动态范围限制在2-3个 数量级

10

1 1.0E-08 1.0E-07 1.0E-06 1.0E-05 1.0E-04 1.0E-03

1.0E

RIGHT ON TIME

2004

ESI:基质对被分析物响应的影响

1. 表面竞争
NH4+ AH+ NH4+ NH4+ A NH4+ AH+ A AH+OAcNH4+OAcNH4+ NH4+ NH4+OAcAH+ A AH+ NH4+ NH4+

被分析物离子与电解质离子 竟相转化为气相离子的竞争 使被分析物响应降低.

电解质浓度

2. 电荷竞争 OAc- + AH+ → HOAc + A

被分析物响应

RIGHT ON TIME

2004

流速对API的影响
ESI 响应随流速的增加而降低 对ESI接口来说,最佳工作流速 为 100-250 ?L/min.

00

0

相对强度

0 1.0 1.5 APCI 空气帮助的 ESI ‘纯’ ESI 2.0

流速ml/min 0.5

2004 RIGHT ON TIME

ESI与溶剂的关系

RIGHT ON TIME

大量实验证明ESI与溶剂密切相关,为促进样品 的电离,要考虑以下因素
样品的结构特性,易形成正离子或负离子。 要有一定的中、高性的溶剂,以利于样品极化。 可利用挥发性酸、碱或其它电解质调节PH值,以 利于形成正、负离子。 为维持稳定的电喷雾,要考虑溶剂表面张力。

RIGHT ON TIME

2004

ESI的特征
MH+,(M + NH4)+,(M + Na)+ , (M + K)+... (M - H)– ,(M + CH3COO)–,(M + Cl)– ...

软电离, 产生准分子离子
正离子 负离子

对很多种类的化合物都有很高的灵敏度
对蛋白质可测到150kDa 中等和高极性化合物 热不稳定化合物 非共价键复合物

高分子量生物大分子和聚合物产生多电荷离子
(M + nH)n+ (M - nH)n–

低分子量化合物一般产生单电荷离子(失去或得到一个质子) 几乎没有碎片离子 可能生成加合物和/或多聚体;常见的是溶剂加合物和NH4 (M+18), Na (M+23), + 和K (M+39) 加合物
+ +

2004 RIGHT ON TIME

ESI(Electrospray)的特点
缺点∶ 相对较低的LC流速。 在溶液中必须离子化。 在高盐条件下会发生离子抑 制。 产生加和离子影响结果。 有限的结构信息。

RIGHT ON TIME

优点∶ 分子量确认 适合于挥发及不挥发的 溶质 适合于离子化及极性的 溶质 好的灵敏度 高分子量测定 适合于毛细管色谱

2004 RIGHT ON TIME

ESI中的多电荷离子
单电荷离子 双电荷离子 多电荷离子 m/z = (M+H)/1 m/z = (M+2H)/2 m/z = (M+nH)/n

RIGHT ON TIME

质谱测定是基于质荷比 (m/z)。

多电荷离子的同位素峰等于 1/n Da (例如,双电荷离子 的质荷比等于 0.5 Da)。 多电荷离子可以扩展质谱的质量范围。

RIGHT ON TIME

2004

多电荷离子

2004 RIGHT ON TIME

多电荷离子
质子化过程-缩氨酸 (GGP)

蛋白

RIGHT ON TIME

H+

H

H N O

H N

O

O N O

O

H

H+

H+
= lone pair of electrons Potential +ve ion charge site

RIGHT ON TIME

2004

多电荷离子的解析
(M + nH)n+ [M + (n-1)H](n-1)+ (n+1)+ [M + (n-2)H](n-2)+

[M + (n+1)H]

m/z

a

b

c

d

M/z轴上,b处离子所带电荷数n(整数)为n =c/(c-b) 分子量可以通过以下公式计算: a x (n + 1) - (n + 1) b x n - n c x (n - 1) - (n - 1) d x (n - 2) - (n - 2) 专用软件可用 (Transform and MaxEnt)

2004 RIGHT ON TIME

多电荷离子簇

RIGHT ON TIME

Horse Heart Myoglobin(马心肌红蛋白)
n = 23, m/z = 738 n = 22 n = 21 n = 20 n = 19 n = 18 n = 17 n = 16, m/z = 1060

RIGHT ON TIME

2004

大气压化学电离 (APCI)

大气压化学电离可分为以下两 个步骤:
快速蒸发 气相化学电离(电晕放电)

1) 离子化过程优先生成溶剂离 子 M=样品

3)离子传送到质量分析器 实现离子分离

x x M

xH + x

M x xH + M x x

x XH + x x MH + x x

MH + xH +

毛细管
电晕放电针

2) 溶剂离子与样品分子反应 生成离子簇

RIGHT ON TIME

2004

APCI Probe

RIGHT ON TIME

2004

APCI源工作原理

APCI电离是在大气压条件下利用尖端高压(电晕) 放电促使溶剂和其他反应物电离、碰撞,及电荷转 移等方式,形成一个反应气等离子区,样品分子通 过等离子区时,发生质子转移,形成了(M+H) 或 (M-H)离子或加和离子。 快速蒸发,液流被强迫通过一根窄的管路使其得 到较高的线速度,给毛细管高温加热及雾化气的 作用使液流在脱离管路的时候蒸发成气体 通过电晕放电,达到气相化学电离

2004 RIGHT ON TIME

APCI源工作原理

RIGHT ON TIME

样品锥孔

H2O H3O+ eN2+ H3O+ N2+ N2+ N2 eH2O+ Corona 放电针 2-5 kV

H2O

N2

H2O+ N2+

Corona 放电区 (Plasma)

N2 H2O

e-

+ +

+ ++

RIGHT ON TIME

高压放电针电流(Corona) 2004

APcI 调谐窗口设置

Positive APcI 0.0 10.0

Negative APcI 0.0 5.0

RIGHT ON TIME

2004

APCI 接口
初级泵 离子源区 涡轮分子泵

提取锥孔 雾化器气 脱溶剂气 隔离阀 样品锥孔 透镜
RF

分析器

排气垫 样品 探头 可清洗 挡板 电晕 放电 针 排气

RIGHT ON TIME

2004

APCI源的特征

软电离,产生准分子离子 MH+,(M + NH4)+ , etc. (M-H)–,(M + CH3COO)–,(M + Cl)– ,etc. 主要产生单电荷离子,几乎没有碎片离子 ,纯气相离子化过程,只产生极 少的添加离子 与ESI相比适于极性较小的化合物, 一般适合分析挥发性化合物,也常分 析从中性到极性的化合物 热不稳定化合物可能会发生降解 可能生成加合物和/或多聚体; 一般是溶剂加合物及NH4+ (M+18), Na+ (M+23), 和 K+(M+39)加合物 受基质影响较小 (相对于 ESI)。 质谱图不受缓冲盐及其缓冲力变化的 影响 流速范围大,从 0.2 到 2.0mL/min ,而不用分流

RIGHT ON TIME

2004

质子亲和力

质子亲合力 (PA) 是气相分子碱性的一个指标。 对于下述反应 SH+ + A→AH+ + S PA (A) > PA (S) 只有当样品的质子亲和力大于溶剂的质子亲和力 的时候,才与样品发生质子交换。 尽量选择质子亲和力(PA)低的溶剂。 (S = 溶剂 , A = 被分析物)

RIGHT ON TIME

2004

常用溶剂的质子亲和力
PA (kcal/mol) 溶剂 PA (kcal/mol)

溶剂

HCl
n-Hexane H 2O TFA MeOH HOAc EtOH n-PrOH ACN

<140
<170 170 176 180 183 190 191 191

i-PrOH Acetone THF EtOAc DMSO DMF TEA

192 197 200 201 210 224 232

2004 RIGHT ON TIME

常见组份的质子亲和力
PA (kcal/mol) 135 172 192 192 196 196 200 200 205 Compound Uracil Pyridine L-Methionine (C6H5)3P L-Lysine 1,7-Diaminoheptane PA(kcal/mol) 208 221 221 230 230 238

RIGHT ON TIME

Compound HCl Formaldehyde Furan p-Xylene Phenol Biphenyl Fluorene Anisole (C2H5)2S

RIGHT ON TIME

2004

气相APCI

化学正离子

RIGHT ON TIME

2004

气相APCI

化学负离子

2004 APcI Mass Spectra of Methyl Prednisolone RIGHT ON TIME
RIGHT ON TIME

Positive Ion Spectra

Without ammonium acetate

With 100 mM ammonium acetate

2004 RIGHT ON TIME
优点∶

RIGHT ON TIME

APCI的特点

利用所得到[M+1]+及[M-1]–进行 分子量确认 源参数调整简单,容易使用 耐受性好,喷雾器及针的位置不 关键 LC流速可达2.0ml/min 好的灵敏度 缺点∶ 有限的结构信息 易发生热裂解 低质量时化学噪声大 不适合做分子量大于1000的化合 物 大多数的接口需要挥发性缓冲液

RIGHT ON TIME

2004

APCI和ESI的不同点

离子产生的方式 APCI利用电晕放电离子化,气相离子化。 ESI利用离子蒸发,液相离子化。 能被分析的化合物类型不同 APCI 弱极性,小分子化合物,且具有一定的挥发性 ESI 极性化合物和生物大分子。 流速 ESI APCI 多电荷 APCI不能生成一系列多电荷离子,所以不适合分析大分子。 ESI 能生成一系列多电荷离子,特别适用于蛋白,多肽类等生 物分子。 0.001到0.25 ml/min。 0.2到2 ml/min。

RIGHT ON TIME

2004

常用的HPLC流动相和添加物
常用添加物 Formic acid (+ mode) Acetic acid (+ mode) Ammonium acetate TFA, trifluoroacetic acid (+ mode) Ammonium carbonate (- mode) Ammonium hydroxide (- mode) TEA, triethylamine (- mode) 不推荐使用的添加物 Phosphoric acid Phosphate buffer Sodium acetate Sodium salts Potassium salts DMSO, dimethylsulfoxide Detergents TFA TEA

常用溶剂 Water Methanol Acetonitrile Isopropanol

RIGHT ON TIME

2004

PH值对 LC/MS分析的影响
Reverse phase HPLC pH adjusted to make analytes stick on the column MS electrospray positive ionization mode (ESI+) pH lowered with acid (e.g. 0.1% formic acid) to add H+ to the analyte to give + charge MS electrospray negative ionization mode (ESI-) pH raised with base (e.g. 10 mM ammonium carbonate) to remove H+ from the analyte to give - charge

RIGHT ON TIME

2004

色谱柱内径和流速
内径 mm 4.6 3.9 2.1 2.0 1.0 0.320 典型流速 流速范围 mL/min 1.0 1.0 – 4.0 Split flow 0.2 – 0.3 0.1 – 1.0 0.050 – 0.100 0.020 – 0.150 0.005 – 0.010 0.001 – 0.002 0.0002 0 MS ESI 脱溶剂气温度

色谱柱

Analytical

300-350?C

Narrowbore

200-250?C

Microbore

100-150?C

Capillary

0.180 0.075

RIGHT ON TIME

2004

LC 分流
UV 检测器 分流器 M.S.

色谱柱 LC 废液瓶

Probe

RIGHT ON TIME

2004

LC 分流
零死体积三通

Analytical Column

ESI Probe PEEK 管路

为了减少进入MS的流动相,可以: 减短废液管路的长度 增加废液管内径 废液瓶,紫外检测器或馏分收集器

2004 使用某些溶剂和添加物需要注意的地方 RIGHT ON TIME
RIGHT ON TIME

TFA - Used with Proteins and Peptides Will suppress (to some extent) positive ion electrospray at levels > 0.1%. Will greatly suppress negative ion electrospray. TEA(三乙胺) Readily ionized to give an intense (M + H)+ ion at m/z 102. Will suppress positive ion electrospray of less basic compounds. May enhance negative ion electrospray of less basic compounds. THF(四氢呋喃) 100% 四氢呋喃易燃. 当使用空气为雾化气的时候,不能用于APCI

RIGHT ON TIME

2004

不适合的溶剂和缓冲液
非挥发性的盐 (phosphate, borate, citrate, etc.) 表面活性剂,清洁剂,去污剂 (会抑制离子化) 无机酸 (sulphuric acid, phosphoric acid etc.)

RIGHT ON TIME

2004

不能使用PEEK管路的溶剂

溶解PEEK Conc. HNO3 Conc. H2SO4

溶涨PEEK DMSO THF CH2Cl2

RIGHT ON TIME

2004

离子化后的情况怎样?

液相色谱的现实情况: 从高效液相色谱流出的化合 物存在于大气压条件下的溶液 之中 质谱的现实情况: 在高真空工作条件下的质谱 仅接受气相的离子 因此液质联用的接口必须完成: 去除溶剂 保留样品 电离化合物
被分析物现在已经变成气相离子 被分析物仍处于大气压下(这是与电子轰 击EI源的本质区别) 我们必须把被分析物送入真空环境中

RIGHT ON TIME

2004

Z-SPRAY 接口

2004 RIGHT ON TIME

API接口:Z-Spray 接口

RIGHT ON TIME

萃取锥孔 毛细管喷口 取样锥孔 RF六极杆 -离子桥

可清洗的金 属挡板

双正交采样技术可避免污染及提高灵敏度

锥孔电压Cone Voltage 2004 RIGHT ON TIME
RIGHT ON TIME

ESI 调谐窗口设置

Cone Voltage 10 100

RIGHT ON TIME

2004

一级真空

雾化气

? ???? ??? ??? ?? ??? ? ? ? ???? ? ?? ? ? ? ? ? ?????? ? ?????? ? ? ? ????? ?? ? ? ? ? ?? ?

?

一级真空

? ?? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?? ?? ? ????????

四级杆

机械泵

RIGHT ON TIME

2004

一级真空

蒸气通过样品锥孔进入一级真空区(离子源区) 并且扩散,膨胀。 蒸气在扩散时会冷却。 这种冷却可能导致在被分析物离子上的溶剂冻结从而生成各种质 量数的簇离子。 成簇过程(Clustering)
S

被分析物离子 溶剂 问题 簇离子会降低所要检测的被分析物质量处 的信号 簇离子会增加背景信号 解决方法 加热一级真空区 (离子源区) 以阻止簇离 子的生成,使不带溶剂的样品离子被检测

AH+
S S

S

S AH+ S S S

S S

AH+S
S

S S

AH+S
S S S

AH+ S
S

>AH+的质量

2004 源温度(Source Temperatures)
RIGHT ON TIME

ESI 调谐窗口设置
Infusion (5 - 40 ?l/min)
Source temp.

80

HPLC (100 - 300 ?l/min)
Source temp.

120

RIGHT ON TIME

2004

API中的源内CID技术
CID(碰撞诱导解离)
CID:Collision Induced Dissociation 源内CID (Up-Front CID) 可获得更多的分子结构信息。

在API源内的亚真空区加速离子,并形成CID。 源内CID时可采用编程的方法改变锥孔(cone)电 压。 源内CID过程与串联MS相同。但它对于母体离子 没有选择性。

RIGHT ON TIME

2004

调节锥孔电压,获得源内CID
Capillary
CID Region

5 - 200 Vdc

From LC Skimmer

RIGHT ON TIME
100
Me Me OH

2004

部分结构信息-CID
O Me OH OH Me O Me O Me Me HO O OMe Me OH
576.4 734.5

Me N O

Me

Cone Voltage = 25V
Me
735.5

%

O Me O

0 100

158.1

Cone Voltage = 65V

%
558.4 577.4 734.5

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

m/z 1000

In-Source CID of Erythromycin

RIGHT ON TIME

2004

多种CID方式: 一次进样得到全部质谱信息

C4H9-

2004 RIGHT ON TIME

锥孔气Cone Gas
ZSPRAY?
取样锥孔

RIGHT ON TIME

脱溶剂气

预六级杆 二级锥孔

锥孔气

ION BLOCK

2004 RIGHT ON TIME

锥孔气Cone Gas

RIGHT ON TIME

ESI+, Full Scan Extracted at m/z 256 Total Run Time > 25 Hr More than 500 mg salt

n=1 n = 509
0.00 0.40 0.80 1.20 1.60

RIGHT ON TIME

2004

Cone Gas

锥孔气可以降低样品和溶剂形成簇离子的几 率,提高灵敏度。

2004 RIGHT ON TIME

离子通道
3. The ions are filtered in MS1 according to their mass to charge ratio (m/z) 4. The mass separated ions undergo CID in the hexapole collision cell 5. The fragment ions are filtered in MS2 according to their mass to charge ratio

RIGHT ON TIME

2. Ions are transferred to the analysers through a hexapole lens

1. Samples from the liquid introduction system enter the ionisation source at atmospheric pressure

6. The ions are detected by an off-axis photomultiplier off-axis detector.

RIGHT ON TIME

2004

二级锥孔和透镜电压Extractor and RF Lens voltages 2004
RIGHT ON TIME

ESI 调谐窗口设置

Extractor Voltage 1 5

RF Lens Voltage 0 0.5

2004 RIGHT ON TIME

SIR (Single Ion Recording)
Q1 Fixed Collision Cell 5-40 eV Q2 Fixed

RIGHT ON TIME

-5V

1V

m1

m1

m1

2004 RIGHT ON TIME

MRM (Multiple Reaction Monitoring
Q1 Fixed Collision Cell 5-40 eV Q2 Fixed

RIGHT ON TIME

-5V

Argon

1V

m1

mx

2004 RIGHT ON TIME

MRM 和SIR 灵敏度比较
Quattro micro API
0.25 pg/?L Carbosulfan STD in a grapes matrix

RIGHT ON TIME

MRM of m/z 381.2 > 118

SIR of m/z 381.2

RIGHT ON TIME

2004

ZQ

Quattro micro API

r2 = 0.998

r2 = 0.993

1 ppb – 5000 ppb
0 0 1000 2000 3000 4000 ppb 5000 0 0 10 20 30 40

0.1 ppb – 100 ppb
50 60 70 80 90 ppb 100

F1:SIR of 11 channels,ES+ 1.960e+005 21.07

F1:MRM of 11 channels,ES+ 5.200e+002

21.07

5 ppb, S/N = 11.1

0.1 ppb, S/N = 10.7

min 18.00 20.00 22.00 24.00

16.0

18.0

20.0

22.0

24.0

min

M/z 221.933

M/z 222.299 > 165.099

2004 RIGHT ON TIME

Product Ion Analysis
Q1 Fixed Collision Cell 5-40 eV Q2 Scanning

RIGHT ON TIME

-5V

Argon

1V

m3 m1 m1 m2

2004 RIGHT ON TIME

Parent Ion Scan
Q1 Scanning Collision Cell 5-40 eV Q2 Fixed

RIGHT ON TIME

-5V

1V

Argon

m1 m2

m3

RIGHT ON TIME

2004

Constant neutral Loss

Q1 Scanning

Collision Cell 5-40 eV

Q2 Scanning

-5V

Argon

1V

m3 m2 m1

m3-x m2-x m1-x

1 and Q2 scan together.

RIGHT ON TIME

2004

Analyser 窗口设置
MS/MS Scanning MRM

MS Scanning

RIGHT ON TIME

2004

六级杆工作原理(离子透镜)RF Lens
RF Lens

?六级杆只被加射频和一个小的直流 偏置电压,所有离子都可以通过。 ?目的是确保离子在相当较低的真空 条件下能够聚焦。 ?将离子聚焦成离子束传输到四级杆 进行分析。 Note: Voltage polarities at any given time.

RIGHT ON TIME

2004

四级杆工作原理

Resonant Ion Nonresonant Ion

Detector

rf and -dc

Source

dc and Rf voltages

rf and +dc

2004 RIGHT ON TIME

四级杆工作原理
一对四级杆被加的电压为:
φ= U – V Cos ωT
(RF Voltage) (DC Voltage)

RIGHT ON TIME

另一对四级杆被加的电压为:
φ= -U + V cos ωT
(DC Voltage) (RF Voltage)

直流高压( DC)范围从0-1000v。 射频RF 范围从 1000 to 6000v。 射频RF (ω)频率大约在 1 MHz。

2004 RIGHT ON TIME

RIGHT ON TIME

四级杆工作原理

Negative rods create a low pass filter

Positive rods create a high pass filter.

Transmission

+

-

+

Transmission

-

+

-

+

Mass

Mass

2004 RIGHT ON TIME

四级杆工作原理

RIGHT ON TIME

Transmission

Mass Scanning the mass range by ‘sliding’ the band pass along the mass scale..

2004 RIGHT ON TIME

四级杆工作原理
低分辨率 (较高灵敏度) 高分辨率 (较低灵敏度)

RIGHT ON TIME

Transmission

Mass

Transmission

Mass

RIGHT ON TIME

2004

四级杆工作原理
Scan Line Const. DC/RF

DC 和 RF 电压的比值一般是一 个常数,代表了分辨率。 增加 DC /RF 比值,增加分 辨率。 提高分辨率,降低灵敏度。 改变质谱的分辨率会改变质谱的 位置。 质谱扫描是DC,RF的电压变化 (扫描),但比值不变(固定分 辨率)。
DC Voltage Intensity

unstable region

m/z 219

m/z 28

m/z 69
Stable oscillation

unstable region

RF Voltage

m/z

离子从形成到被检测到的时间大概是50-100微秒

RIGHT ON TIME

2004

四级杆工作原理(扫描)

2004 RIGHT ON TIME

高端分辨率(HM
1

Resolution)
C

RIGHT ON TIME

Increasing the gradient of the line makes the width of the transmitted stability region less and increases resolution If the gradient of the resolution line is too steep no ions are transmitted In the case of OC maximum resolution is achieved

0 200 250 300 350 400 450 500 550 600

A

O

RIGHT ON TIME

2004

低端分辨率(LM Resolution)

Low Mass Resolution applies a “DC Offset” to the DC Gradient: The effect of this offset is more pronounced (the example above shows the effect of increasing the Low Mass Resolution, but, again, the resolution and sensitivity is affected across the whole mass range DC Offset

2004 RIGHT ON TIME

线性(Linearity)

RIGHT ON TIME

Linearity adjustment introduces a curve shape to the DC Gradient curve The Linearity potentiometer therefore acts the either increase of decrease the resolution in the middle mass range, although the whole mass range is effected

RIGHT ON TIME

2004

预四级和四级杆
四级杆
预四级 四级杆

Rejected ions Stable ion

RIGHT ON TIME

2004

质量分辨率的定义

分辨率通常以下式表达

m ?m
式中 m 是峰质心的 m/z , ?m 是 5%峰高处的峰宽, 或者,更常用的是半峰宽

2004 RIGHT ON TIME
100

质谱分辨率
572.8339

RIGHT ON TIME

[M+H]+ Resolution: 1000
573.9185

同位素峰

%

574.8116
0 100

573.2997

Resolution: 10 000
%

574.3072

575.3155
0 570 571 572 573 574 575 576 577 m/z

RIGHT ON TIME

2004

质谱分辨率

Aim for a peak width of 0.5 - 0.8 amu at half height

Peak width at half height = 0.6

m/?m = 133/0.6 = 222

Peak width at half height = 0.5

m/?m = 1009/0.5 = 2018

2004 M/HM resolution= 15 : Peak width at 1/2 height = 0.6 amu
RIGHT ON TIME

分辨率设置

M/HM resolution= 11 : Peak width at 1/2 height = 1.4 amu 2004
RIGHT ON TIME

分辨率设置

M/HM resolution= 18 : Peak width at 1/2 height = 0.3 amu 2004
RIGHT ON TIME

分辨率设置

RIGHT ON TIME

2004

光电倍增管

dynode phosphor photomultiplier

配有高压打拿极的光电倍 增器,灵敏度高,线性范 围广,可快速的正、负离 子检测 10年的使用寿命

RIGHT ON TIME

2004

光电倍增管

RIGHT ON TIME

2004

光电倍增管电压设置

2004 RIGHT ON TIME

真空状态

RIGHT ON TIME

? Low or rough vacuum: 760 torr - about 1 torr ? Medium vacuum: ? High vacuum: ? Ultra-high vacuum (UHV): about 1 torr - 10-3 torr 10-3 - 10-7 torr <10-7 torr

真空度仅降低10%

1 milliliter of water produces 10,000 liters of vapor at 10-1

2004 RIGHT ON TIME

RIGHT ON TIME

平均最大自由行程

P (torr) 760 1 10-3 10-7 10-10

MFP (in) 2.5 x 10 -6 0.00026 2.62 26,200 (~ 2 5 mile) 2.62 x 10 7 (~ 400 miles)

2 million molecules/cm3

2004 RIGHT ON TIME

真空系统

RIGHT ON TIME

质谱仪之所以在低压下工作是为了 ... 尽量减少离子-分子之间的碰撞 (即,得到最大平均自由 程)
碰撞可能导致离子偏离所期望的由离子源到检测器的通 道 碰撞可能导致产生意外的离子或反应

防止在高电压 (用于某些离子聚焦)下生成电弧 减少污染/化学噪音 好的真空状况意味好的灵敏度

2004 RIGHT ON TIME

真空系统
初级泵 涡轮分子泵

RIGHT ON TIME

1 Torr

10-4 Torr

10-5 Torr

分析器

大气压
760 Torr

2004 RIGHT ON TIME

RIGHT ON TIME

真空系统

离子源

质量分析器

Pirani gauge

涡轮泵

机械泵

RIGHT ON TIME 目的

2004
要求

机械泵油

润滑,冷却,防止机械泵被腐蚀,降低机械噪音… 适当的粘度和润滑性,

建议
使用专用机械泵油
Ultragrade 19 或 Inland Q45

维护
Gas Ballast
ESI 每周一次 APCI每天一次

换油
发现泵油颜色变混 真空度下降 每运行3000小时更换一次泵油 长时间不换油,会降低机械泵的使用寿命,影响真空状态好坏,从而影响

2004 RIGHT ON TIME

进样方式

RIGHT ON TIME

LC 自动进样器进样 质谱直接进样 注射泵连续进样
质量校正 调谐 MCA

RIGHT ON TIME

2004

RIGHT ON TIME

2004

数据采集 - Continuum

连续扫描
每次扫描的数据都会被存下来,可以单独查看每 次扫描的质谱图或者是summed spectrum.

可以得到每个质量点的峰形和分辨率信息
这种扫描数据量非常大。

2004 Data acquired as individual scans RIGHT ON TIME
RIGHT ON TIME

数据采集 - Continuum

Combine across scans of interest to create a summed spectrum

RIGHT ON TIME

2004

数据采集- Centroid

棒状图
每次扫描的数据都会被存下来,可以单独查看每次扫描的 质谱图或者是summed spectrum ,数据虽然按照continuum 方式采集,但被自动处理并以棒状图方式存储 在一个质量点只选择一个代表性的点存储,所得到的谱图 是一根一根棒状的谱图 从棒状图中无法去判断谱图的分辨率,对于没有分开的同 位素峰,可能会造成质量不准确。 文件的数据量小,不会占用很多的硬盘空间,是较常用的 采集方式

2004 Data acquired as individual scans RIGHT ON TIME

数据采集- Centroid

Combine across scans of interest to create a summed spectrum

RIGHT ON TIME

2004

数据采集- MCA

MCA
每次扫描的数据都会被加和在一起 因为噪音信号不会出现在相同位置,所以MCA方式采集的数 据是样品信号叠加,而噪音则是平均,因而能够提高信噪 比 文件数据量要比 continuum 方式小。

Data acquired as one summed spectrum

RIGHT ON TIME

2004

数据采集 - MCA Scanning

2004 RIGHT ON TIME

最高扫描速度

RIGHT ON TIME

Continuum scanning Centroid scanning MCA scanning

1000 amu/sec 2000 amu/sec 1000 amu/sec

虽然仪器的最高扫描速度 4000 amu/sec可以 使用,但是 可能会造成较差的质谱分辨率及质量漂移 ,所有一般 推荐使用500-1200amu/sec的扫描速度

2004 RIGHT ON TIME

基本维护
维护内容
每天 (APCI)

RIGHT ON TIME

频率

机械泵Gas-Ballast 每周(ESI) 检查机械泵状况 更换机械泵油 清洗样品锥孔 清洗Source,二级锥孔 清洗六级杆 每周(ESI) 每3000小时 灵敏度下降 灵敏度下降 灵敏度下降

2004 RIGHT ON TIME

附录-单位
liter (L), mL, ?L, nL
Unit Deci Centi Milli Micro Nano Pico Femto Atto 1 1/10 1/100 1 10e-1 10e-2 10e-6 10e-9 10e-12 10e-15 10e-18

RIGHT ON TIME

体积 流速
mL/min, ?L/min, nL/min


Grams (g), mg, ?g, ng, pg

1/1000 10e-3

浓度
Mole = grams / molecular weight
Mole = 6.02x10e23 molecules moles/L = mmol/mL = M = molar mmol/mL = ?mol/?L nmol/mL = pmol/?L

mg/mL = ?g/?L ng/mL = pg/?L


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